Glykoprofilácia sér, depletovaných sér a imunoglobulínu G u detí v súvislosti s hyperkinetickou poruchou (ADHD) metódou MALDI-TOF MS

Glykozylácia je posttranslačnou modifikáciou, ktorá je bežnou modifikáciou v prípade cicavcov – viac než 50% proteínov je glykozylovaných. Viac než 70% proteínov u ľudí má aspoň jedno glykozylačné miesto, čo robí túto oblasť výskumu – glykomiku – veľmi zaujímavou a prínosnou pre výskum, nakoľko aberantná glykozylácia proteínov je dôležitá vo výskume rôznych typov ochorení, ako napríklad rôzne typy rakovín, autoimunitné, neurodegeneratívne, neurovývojové a psychické ochorenia [1]. Krv je dôležitou telovou tekutinou, ktorá sa skladá z viacerých komponentov – plazmy, krvných doštičiek, červených a bielych krviniek. Približne 55% tvorí krvná plazma a ďalších asi 45% tvoria červené a biele krvinky a krvné doštičky. Krvná plazma je tvorená hlavne vodou (91-92%), zvyšných 8-9% tvoria pevné zložky, medzi ktoré možno zaradiť koagulanty, plazmové proteíny, imunoglobulíny a elektrolyty. Rozdiel medzi krvnou plazmou a krvným sérom spočíva v spôsobe spracovania plnej krvi po jej odbere – plazmu získame, ak ku vzorke plnej krvi pridáme vhodné antikoagulačné činidlo; pokiaľ dôjde ku zrážaniu, získame sérum. Hyperkinetická porucha, alebo aj ADHD (Attention Deficit Hyperactive Disorder) je neurovývojové ochorenie, ktorého hlavnými prejavmi sú hyperaktivita, impulzivita a nepozornosť. Medzi rizikové faktory možno zaradiť genetiku a vplyv prostredia [2].

V našom výskume sme sa zamerali na analýzu glykánov technikou hmotnostnej spektrometrie (MS) vo vzorkách séra (1) a jeho frakcií, depletovaného séra (2) bez albumínu (HSA) a imunoglobulínu G (IgG), a frakcie IgG (3), v súvislosti s hyperkinetickou poruchou. Do výskumu bolo zahrnutých 20 vzoriek sér od detských pacientov – 10 s potvrdenou hyperkinetickou poruchou, 10 od zdravých detí v rámci kontrolnej sady vzoriek. Depletované sérum sme získali pomocou kitu s kolónkou Multiple Affinity Removal Spin Cartridge HSA/IgG (Agilent), frakciu IgG sme získali pomocou kolónky obsahujúcej proteín A. Po zmeraní koncentrácií proteínov v jednotlivých vzorkách sme každú sadu (1-3) spracovali podľa protokolu pre permetyláciu glykánov a zmerali odozvy v jednotlivých vzorkách metódou MALDI-TOF MS (matricou asistovaná laserová desorpcia/ionizácia s hmotnostnou spektrometriou s analyzátorom času letu). Ide o analytickú techniku, ktorá je vhodná aj pre analýzu (glyko)proteínov a peptidov v komplexnejších vzorkách. Pomerne malé množstvo vzorky (1 μl) sa nechá zasušiť na platni spolu s vhodnou matricou, ktorá zabezpečí kryštalizáciu vzorky [3]. Získané dáta sme spracovali pomocou základných štatistických nástrojov. Ako štatisticky významné zmeny medzi skupinou pacientov a kontrol v prípade merania sér možno vyhodnotiť glykánové štruktúry s m/z 1835,93 a 2040,03; v prípade depletovaných sér 2966,47 a 3776,87 a v prípade IgG 1661,8; 2390,18; 2396,18; 2605,3 a 2850,42, kde však pri prvých 3 štruktúrach ide o diskutabilnú štatistickú významnosť, nakoľko priemerné hodnoty relatívnej intenzity boli pod hodnotou 0,5%. MALDI-TOF MS možno použiť ako paralelnú metódu k iným analytickým technikám umožňujúcim analýzu glykánov (napr. na lektínoch založená microarray alebo HPLC s fluorescenčným značením glykánov), nakoľko ide o semi-kvantitatívnu metódu [4]. Na druhej strane, jej výhodou je možnosť komplexnej glykoprofilácie, čiže identifikácia všetkých glykánových štruktúr vo vzorke.

Vznik tejto práce bol podporený vďaka Ministerstvu zdravotníctva Slovenskej republiky v rámci projektu s registračným číslom 2019/7-CHÚSAV-4, a vďaka projektom APVV SK-SRB-18-0028 a COST CA18132. Táto publikácia vznikla vďaka podpore v rámci Operačného programu Integrovaná infraštruktúra pre projekt: CEMBAM - Centrum medicínskeho bioaditívneho výskumu a výroby, ITMS: 313011V358, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja.

[1] Xue Dong et al. (2018) Advances in mass spectrometry-based glycomics, Electrophoresis, 39, 3063-3081. doi: 10.1002/elps.201800273.
[2] Anita Thapar, Miriam Cooper (2016) Attention deficit hyperactivity disorder, Lancet, 387, 1240-1250. doi: 10.1016/S0140-6736(15)00238-X.
[3] Glen N. Hortin (2006) The MALDI-TOF Mass Spectrometric View of the Plasma Proteome and Peptidome, Clinical Chemistry, 52(7), 1223-1237. doi: 10.1373/clinchem.2006.069252.
[4] Lucia Pažitná et al. (2020) Influence of media composition on recombinant monoclonal IgA1 glycosylation analysed by lectin-based protein microarray and MALDI-MS, Journal of Biotechnology, 314-315, 34-40, doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.03.009.