Analýza glykánov rekombinantných IgA microarray metódou založenou na lektínoch a technikou MALDI-MS
| Authors: |
Lucia Pažitná 1
Marek Nemčovič 1
Zuzana Pakanová 1
Peter Baráth 1
Teimur Aliev 2
Dmitry Dolgikh 3,4
Victoria Argentova 3
Jaroslav Katrlík 1
1 Chemický ústav SAV, Bratislava, Slovakia 2 Department of Chemical Enzymology, School of Chemistry, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia 3 Department of Bioengineering, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia 4 Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia |
|---|---|
| Year: | 2020 |
| Section: | Utilization of instrumental methods in the analysis of biologically important substances |
| Abstract No.: | 2007 |
| ISBN: | 978-80-972360-6-9 |
Glykozylácia je jednou z najčastejšie prebiehajúcich posttranslačných modifikácií proteínov vrátane rekombinantných biologických terapeutík, čo z nej robí jeden z kritických atribútov kvality, práve vďaka vplyvu glykánov na funkciu a vlastnosti mnohých terapeutických proteínov. Vlastnosti ako rozpustnosť, termostabilita, biologický polčas, rezistencia voči proteázam, imunogenicita, agregácia a terapeutická účinnosť sú ovplyvňované ich glykozylačným profilom [1]. Čiastočne glykozylované proteíny majú napríklad kratší čas života v porovnaní s plne glykozylovanými proteínmi. Glykozylácia rekombinantných proteínov produkovaných v danom organizme závisí od kultivačných podmienok, akými sú zloženie média, pH a teplota [2]. Imunoglobulíny sú produkované špecifickým imunitným systémom za účelom identifikácie a neutralizovania cudzích antigénov a patogénov, ktorým je organizmus vystavený [3]. Na produkciu terapeutických protilátok sa často používajú cicavčie bunky, pretože takto produkované protilátky obsahujú glykány podobné ľudským. Najčastejšie ide o IgG, ale v súčasnosti sa zvyšuje dopyt po rekombinantných IgA, keďže zohrávajú dôležitú úlohu pri imunologickej ochrane slizničných povrchov a sú prvou obranou proti mnohým vzdušným infekčným ochoreniam ako napr. chrípka, rota vírusy, osýpky a mnohé iné. V práci sme sledovali glykánový profil IgA produkovaných za rôznych podmienok v ovariálnych bunkách čínskeho škrečka (CHO) so zameraním najmä na analýzu N-glykánov. Ako hlavná metóda bola použitá glykoproteínová microarray s využitím lektínov [4]. Vzorky rekombinantných IgA pripravených za rôznych podmienok boli nanášané na epoxidové sklíčka pomocou bezkontaktného spottera vo forme spotov (bodov) o objeme 1,5 nL a následne inkubované s biotinylovanými lektínmi vyznačujúcimi sa rôznou špecificitou a potom s fluorescenčnou značkou konjugovanou so streptavidínom. Vzorky boli taktiež analyzované pomocou MALDI-TOF MS a vybrané štruktúry boli potvrdené pomocou MS/MS [5]. Naša metóda sa javí ako efektívny nástroj na sledovanie glykozylácie a zmien v glykánovom profile u IgA a iných terapeutických proteínov.
[2] Hossler, P., Khattak, S.F., Li, Z.J. Glycobiology. 19, 936-949 (2009).
[3] Zauner, G., Selman, M. H. J., Bondt, A., Rombouts, Y., Blank, D., Deelder, A. M., Wuhrer, M.: Mol. Cell. Proteomics. 12, 856-865 (2013).
[4] Zámorová, M., Holazová, A., Miljuš, G., Robajac, D., Šunderić, M., Malenković, V., Đukanović, B., Gemeiner, P., Katrlík, J., Nedić, O.: Anal. Methods. 9, 2660-2666 (2017).
[5] Pažitná, L., Nemčovič, M., Pakanová, Z., Baráth, P., Aliev, T., Dolgikh, D., Argentova, V., Katrlík, J.: J. Biotechnol. 314-315, 34-40 (2020).