Analýza glykánov rekombinantných IgA microarray metódou založenou na lektínoch a technikou MALDI-MS

Authors: Lucia Pažitná 1    Marek Nemčovič 1    Zuzana Pakanová 1    Peter Baráth 1    Teimur Aliev 2    Dmitry Dolgikh 3,4    Victoria Argentova 3    Jaroslav Katrlík 1   
1 Chemický ústav SAV, Bratislava, Slovakia    2 Department of Chemical Enzymology, School of Chemistry, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia    3 Department of Bioengineering, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia    4 Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia   
Year: 2020
Section: Utilization of instrumental methods in the analysis of biologically important substances
Abstract No.: 2007
ISBN: 978-80-972360-6-9

Glykozylácia je jednou z najčastejšie prebiehajúcich posttranslačných modifikácií  proteínov vrátane rekombinantných biologických terapeutík, čo z nej robí jeden z kritických atribútov kvality, práve vďaka vplyvu glykánov na funkciu a vlastnosti  mnohých terapeutických proteínov. Vlastnosti ako rozpustnosť, termostabilita, biologický polčas, rezistencia voči proteázam, imunogenicita, agregácia a terapeutická účinnosť sú ovplyvňované ich glykozylačným profilom [1]. Čiastočne glykozylované proteíny majú napríklad kratší čas života v porovnaní s plne glykozylovanými proteínmi. Glykozylácia rekombinantných proteínov produkovaných v danom organizme závisí od kultivačných podmienok, akými sú zloženie média, pH a teplota [2]. Imunoglobulíny sú produkované špecifickým imunitným systémom za účelom identifikácie a neutralizovania cudzích antigénov a patogénov, ktorým je organizmus vystavený [3]. Na produkciu terapeutických protilátok sa často používajú cicavčie bunky, pretože takto produkované protilátky obsahujú glykány podobné ľudským. Najčastejšie ide o IgG, ale v súčasnosti sa zvyšuje dopyt po rekombinantných IgA, keďže zohrávajú dôležitú úlohu pri imunologickej ochrane slizničných povrchov a sú prvou obranou proti mnohým vzdušným infekčným ochoreniam ako napr. chrípka, rota vírusy, osýpky a mnohé iné. V práci sme sledovali glykánový profil IgA produkovaných za rôznych podmienok v ovariálnych bunkách čínskeho škrečka (CHO) so zameraním najmä na analýzu N-glykánov. Ako hlavná metóda bola použitá glykoproteínová microarray s využitím lektínov [4]. Vzorky rekombinantných IgA pripravených za rôznych podmienok boli nanášané na epoxidové sklíčka pomocou bezkontaktného spottera vo forme spotov (bodov) o objeme 1,5 nL a následne inkubované s biotinylovanými lektínmi vyznačujúcimi sa rôznou špecificitou a  potom s fluorescenčnou značkou konjugovanou so streptavidínom. Vzorky boli taktiež analyzované pomocou MALDI-TOF MS a vybrané štruktúry boli potvrdené pomocou MS/MS [5]. Naša metóda sa javí ako efektívny nástroj na sledovanie glykozylácie a zmien v glykánovom profile u IgA a iných terapeutických proteínov.

Práca bola podporená grantami APVV-14-0239, VEGA 2/0137/18, VEGA 2/0130/18, 2019/7-CHÚSAV-4, 14.607.21.0177 (ID: RFMEFI60717×0177), COST CA16113 a COST CA18132.
[1] Spearman, M., Lattová, E., Perreault, H., Butler, M.: Bioprocessing Technology for Production of Biopharmaceuticals and Bioproducts, 71-130 (2018).
[2] Hossler, P., Khattak, S.F., Li, Z.J. Glycobiology. 19, 936-949 (2009).
[3] Zauner, G., Selman, M. H. J., Bondt, A., Rombouts, Y., Blank, D., Deelder, A. M., Wuhrer, M.: Mol. Cell. Proteomics. 12, 856-865 (2013).
[4] Zámorová, M., Holazová, A., Miljuš, G., Robajac, D., Šunderić, M., Malenković, V., Đukanović, B., Gemeiner, P., Katrlík, J., Nedić, O.: Anal. Methods. 9, 2660-2666 (2017).
[5] Pažitná, L., Nemčovič, M., Pakanová, Z., Baráth, P., Aliev, T., Dolgikh, D., Argentova, V., Katrlík, J.:  J. Biotechnol. 314-315, 34-40 (2020).