Identifikácia klinických izolátov Clostridioides difficile z vybraných nemocníc v Českej republike
| Authors: |
Veronika Janošcová 1
Jozef Kuzma 1
1 Ostravská univerzita, lekárska fakulta, Ostrava-jih, Česká republika |
|---|---|
| Year: | 2020 |
| Section: | Cellular metabolism, physiology, molecular biology and genetics (clinical trials) |
| Abstract No.: | 1979 |
| ISBN: | 978-80-972360-6-9 |
Clostridium difficile (CD) je sporulujúca, anaeróbna, grampozitívna baktéria, ktorá je v rozvinutých krajinách najčastejšou diagnostikovanou príčinou infekčných hnačiek získaných v nemocničných zariadeniach, tzv. kolitíd spojených s podávaním antibiotík (AAC - Antibiotics Associated Colitis) (Goering et al. 2016).
Metodika: Realizovaný projekt bol zameraný na genotypizáciu - určenie ribotypu a toxinotypu 30 klinických izolátov Clostridioides difficile z vybraných nemocníc v Českej republike - Pardubice, Náchod, Litomyšl.
Vzorka vyšetrovaných pacientov bola vo veku od 51-95 rokov a trpeli na rôzne ochorenia, na ktoré sekundárne nadviazala CDI.
Izolácia, rastové médiá: Vzorky boli kultivované 48 hodín v anaeróbnej atmosfére pri 37,5 ° C na rastovej pôde s použitím Clostridium Difficile Selective Supplement (Oxoid, UK).
Izolácia DNA: DNA bola izolovaná s použitím Chelex 100 (BioRad, ČR) po 24-hodinovej kultivácií v anaeróbnom boxe. Analýza výsledkov prebehla použitím BioNumerics (Applied Maths Inc., USA).
Ribotypizácia: Princíp PCR ribotypizácie je založený na amplifikácii tzv. intergenetic spacer region medzi 16S a 23S rRNA. Postup ribotypizácie bol prevedený podľa metodiky Janežič a Rupnik, 2010.
Toxinotypizácia: Toxinotypizácia je metóda pre diferenciáciu CD podľa zmien v ich tzv. lokuse patogenicity (PaLoc), teda lokusu, ktorý kóduje toxín A (gén tcdA) a B (gén tcdB). Prítomnosť toxigénnych CD bola overená testom Xpect pre CD toxin A/B (Remel, USA).
Determinácia toxínotypov na základe výsledku a prítomnosti kombinácií B1 a A3 reštrikčných typov podľa metodiky Stubbs et al. 2000.
Výsledky: Klinické izoláty pochádzali od 30 pacientov, 11 mužského a 19 ženského pohlavia. Priemerný vek všetkých pacientov bol 76,4 rokov (muži 80,1, ženy 74,3 rokov). V rámci našej štúdie sme diagnostikovali nasledovné ribotypy: 176 (CE), 002, 014, 015, 017, 078, 103, Slo160 a Slo115. Najzastúpenejší bol ribotyp 176 (CE), ktorý sa vo vzorkách vyskytoval až v 70,0 %. Druhým najfrekventovanejším bol ribotyp SLO160 (6,7 %). Ostatné ribotypy sa vyskytovali v zhodnom počte (po 3,3 % vzoriek).
V toxínotype CD vzoriek prevažoval typ 0 (90,0 %), ktorý je zhodný s druhom VPI 10463. Toxínotypy I, II a V sa vyskytli v malom množstve (po 3,3 % vzoriek).
Prítomnosť binárneho toxínu bola pozitívna v 21 vzorkách (70,0 %), v 9 vzorkách binárny toxín prítomný nebol (30,0 %). Binárny toxín bol detekovaný vo výrazne vyššom zastúpení z izolátov od žien (61,9 %), v porovnaní s mužmi (38,1 %).
Záver: Množstvo CDI je nediagnostikovaných, čo vytvára medzeru v epidemiologických záznamoch CD nákaz v ČR. Nové metódy ribotypizácie a toxinotypizácie použité v našom výskume umožňujú presnejšie určenie druhu CD, následkom čoho je možné zlepšiť antibiotickú liečbu CDI i vývoj nových liečiv v prípade zmien v genóme CD a vzniku rezistencií na používané antibiotiká.
2. Janežič S., Rupnik M., Molecular typing methods for Clostridium difficile: pulsed-field gel electrophoresis and PCR ribotyping, Methods Mol Biol., 2010, p. 65-65.
3. Stubbs S,. Rupnik M., Gilbert M., et al 2000, Production of actin-specific ADP-ribosyltransferase (binary toxin) by strains of Clostridium difficile, FEMS Microbiol. Lett., 186:307-312.