Príprava rekombinantného plazmidu s inzertom šaperón-like génu z Cronobacter sakazakii pod indukovateľným lac wt promótorom
Authors: |
Linda Mihálová 1
Eva Struhárňanská 1
Monika Chovanová 1
Zdenko Levarski 2,1
Martin Šafránek 1
Stanislava Bírová 1
Silvia Rybecká 1
Stanislav Stuchlík 2,1
Ján Turňa 2,1
1 Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká fakulta, Bratislava 4, Slovenská republika 2 Univerzita Komenského v Bratislave, Vedecký park, Ilkovičova 8, 84215 Bratislava 4, Slovenská republika |
---|---|
Year: | 2018 |
Section: | Cellular metabolism, physiology, molecular biology and genetics |
Abstract No.: | 1772 |
ISBN: | 978-80-972360-2-1 |
Molekulárne šaperóny predstavujú špecializované proteíny, ktoré participujú pri správnom skladaní novovznikajúcich polypeptidov („de novo folding“), v „refoldingu“ denaturovaných proteínov, a taktiež v ich proteolytickej degradácii [1]. Zistilo sa, že kmene rodu Cronobacter vlastnia genomický ostrov termotolerancie s veľkosťou 15kbp, v ktorom sa identifikovali viaceré gény stresovej odpovede, vrátane šaperón-like sekvencií, ako napr. gén orfD [2]. Pri heterológnej expresii rekombinantných proteínov vo vyššej koncentrácii býva jedným z negatívnych javov tvorba agregátov, tzv. inklúznych teliesok. Renaturácia takýchto agregátov prebieha v bunke E. coli s nízkou frekvenciou, v dôsledku čoho vzniká biologicky neaktívny proteín [3].
Hlavným cieľom našej práce je konštrukcia rekombinantného plazmidu s inzertom génu orfD pod indukovateľným lac wt promótorom.
V našej práci sme úspešne amplifikovali DNA fragmenty s orfD a orfC+D sekvenciami z kmeňa C. sakazakii LMG 5740 pomocou gradientovej PCR. V získaných transformantoch po ligácii vektora s oboma DNA sekvenciami sme pri skríningu zatiaľ nepotvrdili konštrukciu plánovaných rekombinantných plazmidov. V ďalšej práci budeme pokračovať v skríningu rekombinantného plazmidu s vloženým génom orfD, resp. orfC+D, kódujúcim šaperón pod kontrolou indukovateľného lac promótora. Následne využijeme konštrukty pri funkčných štúdiách.
[2] Orieskova M., Kajsik M., Szemes T. et al. (2016) Antonie van Leeuwenhoek 109: p. 405.
[3] Ellis R. J., Minton A. P. (2006) Biol. Chem. 387, p. 48.