Vplyv vhodného výberu detergentu na izolačné a purifikačné kroky membránových proteínov reprezentovaný na proteíne TerC

Membránové proteíny sa zúčastňujú mnohých dôležitých procesov akými je napr. bunková signalizácia. Napriek tomu, štruktúra väčšiny z nich dodnes nie je známa. Nedostatky v určovaní štruktúry membránových proteínov sú spojené s ich komplikovanou produkciou, izoláciou a purifikáciou. Hlavnými prekážkami sú najmä toxicita spojená s ich produkciou a napokon samotná hydrofóbna povaha transmembránových úsekov v štruktúre membránových proteínov. Detergenty predstavujú amfipatické molekuly, ktoré sú schopné od určitej koncentrácie zbaľovať hydrofóbne úseky membránových proteínov do miciel. Výber vhodného detergentu je teda kritickým aspektom pre úspešnú izoláciu a purifikáciu membránových proteínov.

Membránový proteín TerC je jeden z kľúčových proteínov rezistencie na teluričitany, ktorý chceme využiť ako interný štandard v kvantitatívnych hmotnostno-spektrometrických analýzach cicavčích transmembránových proteínov. V tejto práci sme optimalizovali proces izolácie a purifikácie TerC, kedy sme porovnávali využitie troch detergentov – CHAPS, OGP a Nonidetu P-40.

Na základe porovnania Western blot analýz izolácie a purifikácie membránového proteínu TerC špecifickou anti-TerC2 protilátkou, sme určili CHAPS ako najvhodnejší spomedzi uvedených detergentov. Detergent OGP sme vylúčili hneď v prvom kole skríningu, keďže jeho účinkom došlo len k minimálnemu uvoľneniu Trx-TerC z membrán a po purifikácii afinitnou chromatografiou sme na Western blote proteín už nedetegovali. Vo vzorkách z izolácii a purifikácii detergentami CHAPS a Nonidet P-40 sme stanovovali koncentráciu Trx-TerC Bradfordovou metódou v kombinácii s výstupom z programu GelAnalyzer. V prípade purifikácie s CHAPS bola koncentrácia Trx-TerC vo výslednej vzorke po dialýze 4,83µg/ml a v prípade využitia Nonidet P-40 bola táto koncentrácia ešte nižšia – 3,51µg/ml. Napriek tomu, by však bolo vhodné porovnať účinnosť solubilizácie Nonidet P-40 v prítomnosti rôznych koncentrácií solí.

Táto publikácia vznikla vďaka podpore v rámci operačného programu Výskum a inovácie pre projekt: „Univerzitný vedecký park Univerzity Komenského v Bratislave – 2.Fáza“ (ITMS 2014+ 313021D075), projektu „Príprava biologicky aktívnych látok na báze rekombinantných proteínov“ (BIOREKPROT – ITMS: 26240220048) a projektu: „Rozvoj centra excelentnosti pre využitie informačných biomakromolekúl na zlepšenie kvality života (BIOMAKRO2 - ITMS 26240120027), financovaných zo zdrojov ERDF.

[1] Overington J. P., Al-Lazikani B., Hopkins A. L., (2007) Nature Rev. Drug Discov. 5(12), p. 993.
[2] Rawlings, A. E., (2016) Biochemical Society Transactions, 44(3): p.790.
[3] Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J., (2004) Biochim. Biophys. Acta, 1666: p.105.
[4] Valkovičová, L., Minariková-Vávrová, S., Mravec, J., et al. (2013) Antonie van Leeuwenhoek, 104: p.899.
[5] Krchlíková, V., (2017) Stratégie expresie membránového proteínu TerC v Escherichia coli a jeho purifikácia. (Diplomová práca) Prírodovedecká fakulta Univerzity Komenského v Bratislave.
[6] Burian, J., Tu, N., Klučár, L., et al. (1998) Folia Microbiol. 43(6), p.589.