Mikroorganizmy identifikované modernými molekulárno-biologickými metódami v priebehu výroby ľadového vína

Authors: Katarína Ženišová 1    Tomáš Kuchta 1   
1 Národné poľnohospodárske a potravinárske centrum, pracovisko Výskumný ústav potravinársky, Bratislava,   
Year: 2018
Section: Biotechnology and Food Technology
Abstract No.: 1739
ISBN: 978-80-972360-2-1

Ľadové víno je sladký fermentovaný výrobok vyrobený zo zmrazených hroznových bobúľ, ktoré zostali na viniči až do zimy na tvrdé zmrazenie. Takýto druh vína sa vyrába v Európe, najmä v strednej Európe (vrátane Slovenska), v Severnej Amerike (kde je Kanada najväčší svetový producent) a tiež v Japonsku. Charakteristickú chuť a vôňu tohoto vína ovplyvňuje mnoho faktorov, predovšetkým odroda viniča, klimatické podmienky, geologické pomery, spôsob obhospodarovania pôdy, zloženie pôdy a tiež podmienky alkoholového kvasenia. Dôležitý faktor predstavujú tiež mikrobiálne spoločenstvá. Skúmanie pôvodnej mikroflóry v slovenských vinohradníckych oblastiach vedie ku skvalitneniu a používaniu originálnych miestnych kmeňov pri výrobe, miesto zahraničných.

Cieľom našej práce bolo identifikovať mikroflóru prítomnú v bobuliach hrozna, ľadových bobuliach, fermentovanom mušte a ľadovom víne z odrody Veltlín zelený pochádzajúcej z Malokarpatskej oblasti, na čo sme použili moderné molekulárno-biologické metódy umožňujúce detekciu aj nekultivovateľných mikroorganizmov, ktorých prítomnosť nie je možné zistiť klasickými kultivačnými metódami. Mikroflóru sme analyzovali dvoma smermi. Prvým, kultivačným spôsobom sme pomocou selektívnych kultivačných médií izolovali 126 kmeňov kvasiniek a 242 bakteriálnych kmeňov z niekoľkých mikrobiologických médií (YPD, PDA, R2A, GYC, MRS a MRS-T). Jednotlivé izoláty sme charakterizovali pomocou polymerázovej reťazovej reakcie orientovanej na medzerníkovú oblasť medzi génmi ribozomálnej RNA (ITS oblasti) a následne prietokovou elektroforézou Qiaxcel. Izoláty s rozličným profilom amplifikovaných fragmentov DNA sme identifikovali pomocou sekvenovania fragmentov ITS1-5,8S rDNA-ITS2, respektíve génu 16S rRNA. Testovali sme tiež extracelulárne hydrolytické vlastnosti kmeňov a aktivity intracelulárnych esteráz a β-glukozidáz. Druhý, nekultivačný prístup spočíval v analýze DNA a RNA extrahovaných z oplachov bobúľ, muštov a vín, konštrukcii klonových knižníc (bakteriálnych a hubových), selekcii klonov pomocou gélovej elektroforézy v denaturačnom gradiente a sekvenovaní klonov. Kombináciou kultivačného a nekultivačného prístupu sme detegovali baktérie z rodov Staphylococcus, Gluconobacter, Lactobacillus, Ewingella, Leuconostoc, Okobacterium, Lactococcus, Carnobacterium, Sanguibacter, Terrabacter, Enterococcus, Micrococcus, Bacillus, Acetobacter, Propionibacterium, Gordonia Paenibacillus. Kvasinková mikroflóra bola veľmi podobná bežnej vínovej mikroflóre, kde Saccharomyces cerevisiae, Hanseniaspora uvarum a Pichia sp. boli dominantné kvasinky.

Práca prispela k prehĺbeniu vedomostí týkajúcich sa kvasiniek a baktérií relevantných pre slovenské vinárstvo a vinohradníctvo. V práci sme prvýkrát charakterizovali mikroflóru ľadového vína vyrobeného na Slovensku, pričom sme využili kultivačné a nekultivačné metódy. Bola identifikovaná prirodzená mikroflóra, ktorá je charakteristická pre daný región a ovplyvňuje enologické vlastnosti vína.

Práca bola podporená projektom APVV-16-0264: Zvýšenie organoleptickej kvality vína aplikáciou nesacharomycétových koštartérov optimalizovanou na základe analýzy mikroflóry použitím NGS a analýzy arómy a APVV-0344-12: Charakterizácia bakteriálnych spoločenstiev slovenských vín pomocou molekulárno-biologických metód.