Zmena štruktúrno-funkčných vlastností ancestrálneho proteínu pomocou InDel mutagenézy

Authors: Andrea Schenkmayerova 1,2    Veronika Lišková 1,2    Stephane Emond 3    Radka Chaloupkova 1,2    Florian Hollfelder 3    Jiri Damborsky 1,2   
1 Medzinárodné centrum klinického výskumu Fakultnej nemocnice u sv. Anny v Brne, Pekařská 53, 656 91 Brno, Česká republika    2 Loschmidtove laboratóriá, Ústav experimentálnej biológie, RECETOX, Prírodovedecká fakulta, Masarykova Univerzita, Kamenice 5, 625 00 Brno, Česká republika    3 Ústav biochémie, Univerzita Cambridge, 80 Tennis Court Road, Cambridge, CB2 1GA, UK   
Year: 2018
Section: Cellular metabolism, physiology, molecular biology and genetics
Abstract No.: 1711
ISBN: 978-80-972360-2-1

Na základe sekvencií moderných enzýmov bol in silico navrhnutý spoločný predok haloalkán dehalogenázy (HLD, EC 3.8.1.5)1 a Renilla luciferín 2-monooxygenázy (RLuc, EC 1.13.12.5)2. Tento ancestrálny proteín nazvaný AncHLD-RLuc vykazuje obe aktivity, dehalogenázovú (10x nižšiu ako HLD LinB) aj luciferázovú (10000x nižšiu ako RLuc).

Porovnanie kryštálových štruktúr ancestrálneho s modernými enzýmami ukázalo ich vysokú štruktúrnu podobnosť. Hlavný rozdiel je vidieť v usporiadaní sekundárnych štruktúr čiapky a v konformácii slučky, ktorá spája hlavnú doménu a čiapku. Flexibilita tohoto regiónu pravdepodobne prispieva k väzbe luciferínu kolentrazínu.

Náhodné inzercie a delécie boli vnesené do AncHLD-RLuc aby sa zistilo, či zmena v kostre proteínu vedie k zmene v jeho aktivite a špecificite. Vytvorené knižnice boli testované na dehalogenázovú a luciferázovú aktivitu a najaktívnejšie hity boli osekvenované a detailne ocharakterizované. Zaujímavé je, že varianty vykazujúce až 60x vyššiu luciferázovú aktivitu niesli zmeny práve v oblastiach, kde sa štruktúra predka najviac odlišuje od enzýmu RLuc.

H2020 Industrial Leadership Project Rafts4Biotech ID 720776.
  1. 1. Koudelakova T, Bidmanova S, Dvorak P, Pavelka A, Chaloupkova R, Prokop Z, Damborsky J. Biotechnol. J. 2013, 8 (1), 32.
    2. Lorenz WW, McCann RO, Longiaru M, Cormier M.J. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1991, 88 (10), 4438.