Heterologická expresia a purifikácia neuropeptidu ITPL z Bombyx mori v Escherichia coli

Authors: Andrea Hubináková 1    Zdenko Levarski 2    Stanislava Bírová 1    Eva Struhárňanská 1    Stanislav Stuchlík 1    Ján Turňa 1,2   
1 Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká fakulta, Katedra molekulárnej biológie, Mlynská dolina, Ilkovičova 6, 842 15 Bratislava, Slovenská republika    2 Univerzita Komenského v Bratislave, Vedecký park, Ilkovičova 8, 842 16 Bratislava, Slovenská republika   
Year: 2017
Section: Open section for students
Abstract No.: 1692
ISBN: 978-80-972360-1-4

Iónový transportný peptid (ITP) a jeho alternatívna zostrihová varianta, proteín podobný iónovému transportnému peptidu (ITPL) sú hmyzie neuropeptidy. Tieto peptidy boli identifikované ako modulátory homeostatických mechanizmov u hmyzu v prednej časti zadného čreva (ileum). Biologicky aktívny ITPL obsahuje 6 cysteínov, ktoré vytvárajú tri vysoko konzervované intramolekulové disulfidové väzby, podobne ako u ITP [1-2]. Štúdie zamerané na funkciu ITPL u hmyzu nie sú až také rozsiahle a práve z tohto dôvodu sme sa zamerali na produkciu tohto proteínu v Escherichia coli.

Počet disulfidových väzieb a veľkosť ITPL (9 kDa) proteínu vytvára limitácie pri produkcii správne poskladaného proteínu v cytoplazme E. coli. Aj napriek všetkým výhodám produkcie proteínov v E. coli, cytoplazma divokého kmeňa neposkytuje vhodné  prostredie na tvorbu disulfidových väzieb. To môže viesť k vytváraniu nerozpustných agregátov- inklúznych telesiok. Na zníženie alebo zamedzenie tvorby inklúznych teliesok  sa používajú viaceré stratégie napr. použitie jedného alebo kombináciu viacerých fúznych partnerov, optimalizácia kultivačných podmienok, zloženie média a teplota pri heterologickej expresii, a iné [3-4].

Cieľom tohto projektu je nadprodukcia fúzneho proteínu ITPL (23 kDa) v solubilnej forme a jeho purifikácia na následné využitie pri funkčných štúdiách v hmyzom modelovom organizme, Bombyx mori.

Táto publikácia vznikla vďaka podpore v rámci operačného programu Výskum a inovácie pre projekt: Univerzitný vedecký park Univerzity Komenského v Bratislave – 2. Fáza, ITMS 2014+ 313021D075, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja.“ a tiež projektu „Príprava biologicky aktívnych látok na báze rekombinantných proteínov“ (BIOREKPROT - ITMS: 26240220048).
[1] Meredith J., Ring M., Macins A., et al. (1996) J. Exp. Biol. 199(Pt5), p. 1053.
[2] Nagai C., Mabashi-Asazuma H., Nagasawa H., et al. (2014) J. Biol. Chem 289(46), p. 32166.
[3] Levarski Z., Šoltýsová A., Krahulec J., et al. (2014) Protein Expres. Purif. 100, p. 40.
[4] Ke N., Berkmen M. (2014) Curr. Protoc. Mol. Biol. 108(16), p. 1.