Efektívna stratégia expresie transmembránového proteínu TerC a jeho počiatočná purifikácia

Escherichia coli je jedným z najviac využívaných expresných systémov na nadprodukciu prokaryotických aj eukaryotických proteínov. Existuje množstvo nástrojov a protokolov na vysokú produkciu heterologických proteínov, množstvo expresných plazmidov, bakteriálnych kmeňov a kultivačných stratégii, ktoré sa dajú použiť. Produkcia rekombinantného proteínu je pre hostiteľskú bunku záťažou, pričom v extrémnych prípadoch ani nedochádza k expresii daného proteínu alebo dochádza k akumulácii degradovaného proteínu, prípadne proteín spadá do inklúznych teliesok. [1]. Na efektívnu expresiu problémových membránových proteínov sa preto často využívajú rôzni fúzni partneri, ktorí monitorujú expresiu proteínu alebo jeho ľahšiu purifikáciu. Medzi najznámejších fúznych partnerov patrí His-tag, tioredoxín alebo GFP [2,3]. Ďalšou z možných stratégii je koexpresia chaperónov, ktoré napomáhajú správnemu skladaniu proteínu [4]. V tejto práci sme sa zamerali na transmembránový proteín TerC pochádzajúci z teluričitanového operónu, ktorého presná štruktúra a funkcia nie je doposiaľ známa [5].

Cieľom tejto práce je exprimovať a purifikovať proteín TerC v E. coli. Membránový proteín TerC by sa mohol ďalej využiť ako interný proteínový štandard pre ostatné membránové proteíny pri hmotnostnej spektrometrii.

Podarilo sa nám exprimovať proteín TerC vo fúzii s tioredoxínom, ktorý  zvyšuje jeho rozpustnosť. Úspešnosť expresie sme overili pomocou SDS-PAGE. Následne sme TerC purifikovali pomocou ultracentrifugácie a afinitnej chromatografie. Pomocou Western blotu sme overili prítomnosť proteínu TerC vo vzorke a na géli po SDS-PAGE analýze sme zistili, že TerC je kontaminovaný inými proteínmi. Preto sú potrebné ďalšie purifikačné kroky, ktorými by sme dosiahli vyššiu čistotu proteínu TerC.

Táto publikácia vznikla vďaka podpore v rámci operačného programu Výskum a inovácie pre projekt: "Univerzitný vedecký park Univerzity Komenského v Bratislave – 2. Fáza" (ITMS 2014+ 313021D075), a tiež projektu: „Príprava biologicky aktívnych látok na báze rekombinantných proteínov“ (BIOREKPROT - ITMS: 26240220048), financovaných zo zdrojov ERDF.

[1] Rosano G.L., Ceccarelli E.A. (2014) Front. Microbiol. 5, p. 172.
[2] Chaga G.S. (2001) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 49, p. 313.
[3] Drew D., Lerch M., Kunji E., Slotboom D-J., de Gier J-W. (2006) Nature Methods 3, p. 303.
[4] Nannenga B.L., Baneyx F. (2011) Protein Sci. 20, p. 1411.
[5] Anantharaman V., Iyer L.M., Aravind L. (2012) Mol. Biosyst. 8, p. 3142.