Optimalizácia enzymatickej syntézy etyl-α-galaktozidu

Authors: Nikola Mojtova 1    Elena Karnišová Potocká 2    Mária Mastihubová 2    Vladimír Mastihuba 2   
1 Fakulta prírodných vied, Univerzita sv. Cyrila a Metoda v Trnave, Slovensko    2 Laboratórium biokatalýzy a organickej syntézy, Chemický ústav, Slovenská akadémia vied, Bratislava, Slovensko   
Year: 2017
Section: Open section for students
Abstract No.: 1683
ISBN: 978-80-972360-1-4

Cieľom práce bolo pripraviť etyl α-galaktozid ako štandard pre HPLC metódu pri skríningu transglykozylačných aktivít v rôznych komerčných a rastlinných zdrojoch.

V tejto práci sme hľadali vhodný zdroj a-galaktozidázy. Porovnaná bola syntéza pomocou a-galaktozidázy z komerčného prípravku Viscozyme L so špecifickou a-galaktozidázou DS (Amano). Následne boli optimalizované podmienky prípravy etyl α-galaktozidu vzhľadom ku koncentrácii melibiózy, etanolu a množstvu katalyzátora.

Priebeh reakcií pri optimalizácii reakčných podmienok bol sledovaný pomocou HPLC. Optimálne podmienky pre a-galaktozidázu DS boli stanovené nasledovne: 20% etanol vo vode, koncentrácia enzýmu 10 mg/mL a 0,8M melibióza bola použitá na základe predošlých výsledkov. Reakčná zmes bola inkubovaná pri 40 °C, 175rpm. Po 7 hodinách bola reakcia zastavená varom na vodnom kúpeli po dobu 5 minút, zmes bola následne prefiltrovanáa zahustená. Väčšina voľných sacharidov bola vyzrážaná z vodného roztoku etanolom, potom bol produkt izolovaný na kolóne so zmesou aktívneho uhlia aCelite® 545 (1:1), elúciou vodou. Frakcie obsahujúce produkt a zvyšky voľných sacharidov boli následne separované na kolóne silikagélu gradientom metanolu v chloroforme.

Pomocou a-galaktozidázy DS sa podarilo pripraviť etyl α-galaktozid s výťažkom 2,64% (0,55g) (pri Viscozyme L – 0,17 % (0,0351g)). Štruktúra produktu bola analyzovaná pomocou NMR spektroskopie.