Optimalizácia produkcie kataláz-peroxidáz využitím chaperónovej koexpresie

Katalázy-peroxidázy sú hémové bifunkčné enzýmy, ktoré vykazujú katalázovú a zároveň aj peroxidázovú aktivitu. Vďaka svojej vysokej katalázovej aktivite už našli využitie v rôznych odvetviach priemyslu a ich peroxidázová aktivita ponúka nové možnosti ich využitia.

Chaperóny sú proteíny, ktoré sa podieľajú na zbaľovaní („folding“) proteínov a to niekoľkými spôsobmi: a) fungujú ako foldázy, teda podporujú správne zloženie proteínov [1], b) zabraňujú precipitácii proteínov tým, že zamedzujú intermolekulárnym interakciám ešte nezbalených proteínov [1], c) zabraňujú predčasnému zbaleniu proteínov [2]. Sú však objavované aj nové funkcie chaperónov, vďaka ktorým napomáhajú skladaniu.

Cieľom tejto práce bolo zvýšenie produkcie solubilných kataláz-peroxidáz v Escherichia coli.

Na produkciu enzýmov sme použili kmene E. coli s dvojplazmidovým systémom, kde prvý plazmid pGro7 (Takara Bio Inc) obsahoval gény pre chaperóny groEL/ES a druhý plazmid0 niesol buď gén pre mutovanú katalázu-peroxidázu AfKatG (A proteín) alebo gén pre 8x mutovanú C-terminálnu doménu peroxidázy z Magnaporthe grisea (B proteín). Heterológna expresia prebiehala v Erlenmayerových bankách po dobu 16 – 20 hod pri 20 °C, keďže predchádzajúce štúdie ukázali, že pri zníženej kultivačnej teplote sa tvorí väčšie množstvo cieľových proteínov. Proteín B sa síce v malej miere produkoval v solubilnej forme, avšak pri porovnaní s expresiou bez chaperónov sme nezaznamenali žiadne zlepšenie. Pri koexpresii chaperónov s génom A sa nám podarilo zvýšiť solubilnú frakciu A proteínu o 45 – 90 % oproti expresii bez chaperónov. Zavedené mutácie by mali zvyšovať peroxidázovú aktivitu, čo sa nám však nepodarilo potvrdiť.

V budúcnosti je potrebné navrhnúť a overiť nové mutácie daných génov a tiež optimalizovať ich produkciu.

Príspevok je výsledkom realizácie projektu Agentúry na podporu výskumu a vývoja (APVV-14-0375) a tiež vďaka podpore v rámci operačného programu Výskum a inovácie pre projekt: Univerzitný vedecký park Univerzity Komenského v Bratislave – 2. Fáza, ITMS 2014+ 313021D075, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja.

[1] Hoffmann, J. R. H., Linke, K., Graf, P. C., Lilie, H., Jakob, U. (2003). Identification of a redox-regulated chaperone network. The EMBO Journal. 23 (1): 160–168.
[2] Ellis R. J. (2007). Protein misassembly: macromolecular crowding and molecular chaperones. Adv. Exp. Med. Biol. Advances in Experimental Medicine and Biology. 594: 1–13.