Rekombinantné fragmenty protilátok využité v biosenzoroch pre spoľahlivejšiu diagnostiku rakoviny prostaty

Glykány, tvorené reťazcami sacharidov, sa v tele vyskytujú nielen ako súčasť biomolekúl (glykoproteíny, glykolipidy, peptidoglykány), ale môžeme ich nájsť aj na povrchu buniek. Zatiaľ bolo identifikovaných takmer 160 rôznych funkcií glykánov – od bunkovej signalizácie či adhézie, až po imunitnú odpoveď. Glykány však zohrávajú významnú úlohu aj pri vývoji a priebehu rôznych ochorení, vrátane autoimunitných či onkologických [1]. Z tohto dôvodu sa štúdiu glykánov venuje zvýšená pozornosť pri vývoji spoľahlivejších diagnostických metód, vrátane diagnostiky rakoviny prostaty. Táto je v súčasnosti založená na meraní koncentrácie biomarkeru – prostatického špecifického antigénu (PSA) v krvi. Koncentrácia PSA v krvi zdravých jedincov dosahuje hodnoty do 4ng/ml, avšak v prípade rakoviny prostaty dochádza k narušeniu tkaniva a vyplavovaniu PSA do krvného obehu, čo spôsobuje nárast koncentrácie PSA aj nad 10ng/ml. Veľkým problémom je však nízka špecificita PSA ako biomarkeru, nakoľko zvýšenie jeho hladiny v krvi môže byť spôsobené aj iným ako nádorovým ochorením (nezhubné zväčšenie prostaty, prostatitída) či dokonca zvýšenou fyzickou aktivitou alebo vekom [2]. Tieto problémy môže vyriešiť inovatívny prístup k PSA ako biomarkeru, a to zameranie sa na štruktúru jeho glykánu. Zmeny v glykozylácii proteínov sú sprievodným znakom onkogenézy a ich sledovaním je možné odlíšiť proteín zo zdravého tkaniva od proteínu z nádorového tkaniva, bez ohľadu na jeho koncentráciu, ktorej sledovanie samotné môže poskytovať falošne pozitívne či negatívne výsledky [3].

Pre analýzu glykánov boli využité lektíny - proteíny špecificky viažuce sacharidy. Lektín interagujúci s glykánom na PSA z nádorového tkaniva nebude interagovať s PSA z nenádorového tkaniva a na tomto princípe bol založený náš prístup, kedy sme  lektín inkorporovali do biosenzoru  pre PSA. Aby ale bolo možné analyzovať reálne vzorky akou je napríklad krvné sérum, je nutné povrch biosenzoru upraviť tak, aby bol špecifický len pre sledovaný analyt (PSA). Svätým grálom biosenzorov sa tak stali protilátky. Problemóm pri analýze glykánového profilu je však to, že protilátky samotné su glykozylované a môžu interferovať s lektínom, čím kompromitujú celú analýzu, čo potvrdili aj naše experimenty pomocou povrchovej plazmónovej rezonancie (SPR). Konvenčným riešením je chemická derivatizácia glykánov protilátky, ktorá je však veľmi pracná. Nami prezentovaný moderný prístup spočíva vo vytvorení rekombinantných fragmentov protilátok, ktoré si zachovávajú rovnakú afinitu k analytu, avšak pozostávajú iba z rozpoznávajúcich domén pôvodnej protilátky, a teda neobsahujú vo svojej štruktúre glykán. S použitím citlivých elektrochemických metód ako elektrochemická impedančná spektroskopia (EIS) sme boli schopní detegovať PSA v klinicky relevantnom rozsahu koncentrácii (0,1 – 100 ng/ml) a zároveň vykonať glykoprofiláciu prostredníctvom zvoleného lektínu, za súčasnej eliminácie nežiaducich interakcií medzi lektínom a povrchom biosenzoru.

Táto práca bola financovaná v rámci programu FP7 Európskej únie, prostredníctvom Marie Curie ITN PROSENSE (grant 317420), programu Európskej komisie pre výskum (grant ERC 311532), projektu Slovenskej agentúry pre podporu výskumu a vývoja APVV-14-0753 a projektu VEGA 2/0162/14.

[1] Varki, A. Glycobiology 27.1 (2017): 3-49.
[2] Janbaziroudsari, H., et al. Bulletin du Cancer 103.9 (2016): 730-734.
[3] Klukova, L., et al. Analytica Chimica Acta 853 (2015): 555-562.