Optimalizácia metodiky skríningu mutácii génu PTEN vo vzorkách endometria
| Authors: |
Petra Priščáková 1
Iveta Gašparová 1
Soňa Režnáková 1
Vanda Repiská 2
1 Ústav lekárskej biológie, genetiky a klinickej genetiky LFUK 2 Ústav lekárskej biológie, genetiky a klinickej genetiky LFUK a Medirex Group Academy n.o. |
|---|---|
| Year: | 2017 |
| Section: | Cellular metabolism, physiology, molecular biology and genetics |
| Abstract No.: | 1577 |
| ISBN: | 978-80-972360-1-4 |
ÚVOD: Karcinóm endometria patrí medzi nádory, ktoré majú na Slovensku dlhodobo stúpajúcu incidenciu. Endometrioidný karcinóm endometria a serózny karcinóm endometria, ktoré predstavujú hlavné fenotypy I. typu a II. typu endometriálneho karcinómu, majú charakteristicky odlišné typy genetickej nestability a molekulárnych zmien. Najčastejšie mutovaným génom v endometrioidnom karcinóme je tumor-supresorový gén PTEN. Optimalizácia skladovania biologického materiálu vhodná pre histologické vyšetrenie a zároveň pre metodiku podrobnej sekvenačnej analýzy bola nevyhnutná pred začatím identifikácie zmien PTEN génu v epiteli endometria, ktorý už vykazuje prekancerózne zmeny predchádzajúce endometriálny karcinóm a v malígnych karcinómoch endometria.
METÓDY A VÝSLEDKY: Pre potreby priameho sekvenovania bola z hľadiska kvality a kvantity vhodná DNA izolovaná z biopsií uskladnených zmrazením pri -20°C. Avšak RNA pre paralelné štúdium génovej expresie je v takto uchovávaných vzorkách degradovaná a navyše izolovaná DNA nepochádza z konkrétnej, histopatologicky exaktne definovanej časti odobraného tkaniva. V takýchto biopsiách sú prítomné bunky z okolitého zdravého tkaniva, ktoré môžu poskytovať falošne negatívne výsledky. Pristúpili sme preto k fixácii vzoriek formalínom a ich následnému zaliatiu do parafínu. Takto upravené vzorky mali viacero výhod. Nedochádzalo k strate DNA, RNA a proteínov, po identifikácii a následnej izolácii zvolenej časti biopsie (ktorá bez fixácie nie je realizovateľná), bolo možné následne robiť molekulovo-genetickú analýzu homogénneho tkaniva a do štúdie bolo možné zahrnúť aj staršie, v minulosti spracované biopsie. Veľkou nevýhodou však zostala skutočnosť, že hoci je formalín jeden z najvhodnejších fixatív pre morfologické štúdie tkanív, je zároveň veľmi toxický, mení štruktúru nukleových kyselín a integritu proteínov. Preto bolo v prvom momente navrhnuté pristúpiť k dvojitému uchovávaniu vzoriek, a to jednak zmrazením pre potreby DNA analýzy, ako aj fixáciou formalínom s následným zaliatím do parafínu pre štúdium expresie. Tento variant však nerieši problém s nehomogénnosťou tkaniva v biopsiách pri DNA analýze.
ZÁVER: Otestovať v literatúre odporúčané netoxické fixačné činidlo RCL2®-CS100 (ALPHELYS, Plaisir, France), ktoré nespôsobuje sieťovanie molekúl, poskytuje vhodné zachytenie morfológie fixovaných tkanív a zároveň postačujúcu kvalitu nukleových kyselín.