Izolácia genomickej DNA z troch druhov drobného ovocia

Authors: Júlia Hunková 1    Andrea Hricová 1    Alena Gajdošová 1   
1 Ústav genetiky a biotechnológií rastlín, Centrum biológie rastlín a biodiverzity SAV, Nitra, Slovensko   
Year: 2017
Section: Biotechnology and Food Technology
Abstract No.: 1502
ISBN: 978-80-972360-1-4

Izolácia nukleových kyselín je základom pre množstvo molekulárno-biologických analýz. Hoci je DNA menej náchylná na kontamináciu a degradáciu v porovnaní s RNA, v prípade drobného ovocia môže byť jej izolácia problémová. Dôvodom sú hlavne vysoké hladiny polyfenolov a iných zložiek v pletivách rastliny, ktoré vo výsledku znižujú celkový výťažok DNA [1].

Cieľom práce bolo porovnať dva spôsoby izolácie genomickej DNA (gDNA)  z in vitro rastlín druhov Vaccinium corymbosum (čučoriedka chocholíkatá), Rubus fruticosus L. (ostružina černicová) a Amelanchier alnifolia var. cusickii (muchovník jelšolistý). Testovali sme extrakciu DNA pomocou komerčnej izolačnej súpravy GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific) a pomocou metódy podľa Doyle a Doyle [2] založenej na  rozrušení bunkovej steny rastlinných pletív pridaním CTAB (cetyltrimetylamónium bromid) do lyzačného roztoku. Na izoláciu DNA sme použili 120 mg čerstvých listov. Koncentrácia DNA bola meraná pomocou Nanodropu (BioSpec-nano, Shimadzu Corp.) a integrita DNA bolo kontrolovaná vizuálne detekciou na 1% agarózovom géli.

Výsledky ukázali, že izolácia komerčnou izolačnou súpravou nie je účinná na izoláciu DNA testovaných druhov drobného ovocia. Koncentrácia extrahovanej DNA sa pohybovala v rozmedzí 23 – 82 ng.μl-1 (pre všetky druhy). Koncentrácia DNA bola tak nízka, že jej elektroforetická detekcia na agarózovom géli nebola možná. Izolácia pomocou CTAB sa pri  pri všetkých testovaných druhoch javila efektívnejšia. Koncentrácia DNA získanej po izolácii sa pohybovala v rozmedzí 146 – 797 ng.μl-1 (V. corymbosum), 203 – 654 ng.μl-1 (R. fruticosus) a 155 – 769 ng.μl-1 (A. alnifolia). Kvalitu extrahovanej gDNA bolo možné elektroforeticky stanoviť v agarózovom géli.

Záverom možno povedať, že metóda založená na pridaní CTAB je účinnejšou pre izoláciu vysokého výťažku kvalitnej DNA  všetkých troch testovaných druhov drobného ovocia. Takto izolovanú DNA je možné následne použiť pre ďalšie molekulárno-biologické analýzy ako napr. amplifikáciu záujmových sekvencií, restrikčnú analýzu, sekvenačnú analýzu a pod.

Príspevok vznikol s podporou Výskumného centra AgroBioTech vybudovaného v rámci projektu Vybudovanie výskumného centra „AgroBioTech“ ITMS 26220220180. Práca bola podporovaná aj grantom VEGA 2/0052/17.
[1] Dragovic-Uzelac V., Savic Z., Brala A., et al. (2010). Food Technology and Biotechnology. 48: 214–221.

[2] Doyle J.J., Doyle J.L. (1990). Focus. 12: 13-15.