Príprava vektora na expresiu alkohol dehydrogenázy s N-terminálnym glykozylačným miestom v Escherichia coli
| Authors: |
Simona Nôtová 1
Stanislava Bírová 1
Zdenko Levarski 2
Eva Struhárňanská 1
Stanislav Stuchlík 1
Ján Turňa 1,2
1 Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká Fakulta, Katedra molekulárnej biológie, Mlynská dolina, 842 15 Bratislava, Slovenská Republika 2 Univerzita Komenského v Bratislave, Univerzitný vedecký park, Ilkovičova 8, 842 16 Bratislava, Slovenská republika |
|---|---|
| Year: | 2016 |
| Section: | Open section for students |
| Abstract No.: | 1475 |
| ISBN: | 978-80-972360-0-7 |
Jedna z mnohých posttranslačných modifikácií, ktorým proteíny podliehajú, je glykozylácia. Napriek dlho pretrvávajúcemu názoru, že N-glykozylácia a O-glykozylácia sú striktne viazané na eukaryotické organizmy, je dnes jasne dokázaná aj ich prítomnosť v baktériách a archeónoch [1]. Z biotechnologického hľadiska, sa prokaryotická glykozylácia stala predmetom záujmu viacerých vedeckých laboratórií a tímov od charakterizácie a úspešného prenosu N-viazanej glykozylačnej dráhy z Campylobacter jejuni do Escherichia coli v roku 2002 [2].
Cieľom našej práce je expresia glykozylovanej alkohol dehydrogenázy (ADH) zo Saccharomyces cerevisiae s možnosťou imobilizácie prostredníctvom naviazaných glykánov. Jej enzýmová aktivita, ktorá by v ideálnom prípade zostala zachovaná pre biotechnologické účely práve vďaka imobilizácii, predstavuje perspektívny prístup k produkcii dôležitých komponentov potravinárskeho či kozmetického priemyslu [3]. Jeden z prvých medzistupňov k dosiahnutiu konečného cieľa je zároveň predmetom tejto práce, čo obnáša prípravu expresného vektora nesúceho gén kódujúci ADH obohatený o N-terminálne sekvencie rozoznávané enzýmom PglB katalyzujúcim prenos glykánu na Asn zvyšok proteínu (ADHN-GT).
Využitím techník rekombinantnej DNA a analytických metód, ako SDS PAGE a Dot Blot, sme vytvorili stabilný expresný systém E. coli nesúci plazmid s génom pre ADH proteín s N-terminálnymi glykozylačnými miestami (ADHN-GT). Jeho vznik sme dokázali agarózovou elektroforézou a produkcia ADHN-GT bola potvrdená po 24 h expresii metódou Dot Blot. Vzhľadom na možnosť expresie glykozylovaných proteínov len v periplazme bude v budúcnosti potrebné optimalizovať tento krok v rámci expresie ADHN-GT (prípadne iných modifikácií ADH), ako aj efektívnu a spoľahlivú extrakciu proteínov z periplazmatického priestoru. Po zvládnutí týchto krokov budú nasledovať purifikačné prístupy, stanovenie enzýmovej kinetiky a finálny cieľ predstavuje imobilizácia ADH prostredníctvom cukorných zvyškov na vhodnú matricu.
[2] Wacker M., Linton D., Hitchen P. G., Nita-Lazar M., Haslam S. M., North S. J., Panico M., Morris H. R., Dell A., Wren B. W., Aebi M. (2002) Science 298, p. 1790.
[3] Ben Akacha N., Gargouri M. (2009) Process Biochem. 44(10), p. 1122.