Studium expresie u Candida utilis

U kvasinek je sekrece proteinů řízena sekreční signální sekvencí na N-terminálním konci polypeptidu, která zabezpečuje a kontroluje vstup proteinu do sekrečních drah. Klasický signální peptid obsahuje nabitý N-konec, centrální hydrofóbní jádro a na C-terminálním konci obsahuje konsenzus sekvencii, která je rozpoznávána a štěpena peptidázami v endoplazmatickem retikulu. Pre- a pro- oblasti sekretovaného proteinu představují sekvencie, které jsou rozpoznávané a štěpené v endoplazmatickem retikule a Golgiho aparátě během translokace proteinu a zabezpečují přechod cílového proteinu z cytoplazmy až do GA [1]. Candida utilis je přiřazována k potenciálním hostitelským organismům vhodným pro extracelulární produkci heterologických proteinů. Převážná většina rodu Candida je zařazována do tzv. CUG rodiny, která je charakteristická tím, že překladá CUG kodon jako serín na rozdíl od univerzálního leucínu [2]. Cílem naší práce je příprava plazmidu obsahujícího α glukozidázový gen a invertázový sekreční signál. Exprese α glukozidázového genu bude regulována α glukozidázovým promotorem. Tento konstrukt slouží jako analog k tzv. detekčnímu plazmidu, který byl rovnako připraven v našem laboratoriu. Rozdíl mezi těmito konstrukty je v tom, že detekční plazmid obsahuje α glukozidázový gen modifikovaný o štěpné místo pro enterokinázu a 6x His-tag. Dalším cílem je výměna promotorové oblasti α glukozidázového genu za silný konstitutivní promotor GAP pro porovnání hladiny expresie. Oba plazmidy jsou potřebné pro analyzování zda přítomný sekreční invertázový signál způsobí přesun α glukozidázi do média.

1. [1] Delic M., Valli M., Graf A. B., et al. (2013) Fems Microbiol Rev. 37(6), p 872.
   [2] Massey S. E., Moura G., Beltrão P., et al. (2003) Genome Res. 13(4), p. 544.