Stabilita mezenchýmových kmeňových buniek v in vitro kultúre a ich použitie v bunkovej terapii

Authors: Lukáš Zachar 1    Darina Bačenková 1    Ján Rosocha 1   
1 Združená tkanivová banka LF UPJŠ a UN LP v Košiciach, Košice, SR   
Year: 2016
Section: Cellular metabolism, physiology, molecular biology and genetics
Abstract No.: 1392
ISBN: 978-80-972360-0-7

Ľudské mezenchýmové kmeňové bunky (MSCs) si získali pozornosť v oblasti regeneračnej medicíny a bunkovej terapie vďaka ich výrazným imunomodulačným vlastnostiam, nízkej imunogenite, schopnosti migrovať do miesta poškodenia a aj potenciálu diferencovať sa do mnohých bunkových línii nie len mezenchymálneho pôvodu [1]. Po cielenej aktivácii prozápalovými cytokínmi sú MSCs schopné vykonávať svoje modulačné funkcie, ktorých výsledok závisí na interakcii rôznych faktorov, s častokrát opačne pôsobiacimi účinkami. Doteraz bol popísaný celý rad účinných mechanizmov, ktorými sú MSCs schopné ovplyvňovať jednak vrodené, ale aj adaptívne imunitné odpovede organizmu. Kľúčovým v tomto procese je parakrinné pôsobenie faktorov lokálneho zápalového prostredia [2].

Získané experimentálne dôkazy spôsobili výrazné posuny záväzných pohľadoch na mechanizmy pôsobenia MSCs v zápalovom prostredí. Spočiatku boli MSCs skúmané ako 1) „feeder layers“, zabezpečujúce adekvátne prostredie pre kultiváciu hematopoetických buniek. Neskôr boli skúmané ako 2) bunky schopné reparácie, prostredníctvom diferenciácie do buniek funkčného tkaniva. V poslednej dobe experimentálne dáta ukazujú, že 3) aktivované MSCs sa vo väčšine prípadov iba prechodne objavujú v poškodenom tkanive. Vzájomne však interagujú s imunitnými bunkami a bunkami poškodeného tkaniva, s cieľom obmedziť deštrukciu tkaniva a zvýšiť intenzitu reparačných a regeneračných mechanizmov, prostredníctvom zabezpečenia ochrannej niky pre zvýšenie proliferácie a diferenciácie endogénnych progenitorových buniek daného tkaniva [3].

Pre experimentálne a klinické použitie MSCs je však nutná ich extenzívna in vitro amplifikácia. Z toho dôvodu treba uvažovať aj o riziku potenciálneho nahromadenia genetických a epigenetických zmien súvisiacich so stratou charakteristických diferenciačných a modulačných vlastností a senescenciou.

U ľudských MSCs bola preukázaná schopnosť expanzie až do 20. pasáže, pričom existujú sporné výsledky o tom, do akej pasáže môžu byť MSCs expandované, než sa u nich vyskytne chromozomálna nestabilita a strata multipotencie.

Rozsiahlou analýzou MSCs v podmienkach dlhodobej in vitro kultivácie bolo preto skúmané, či si kultúry týchto buniek zachovávajú svoj charakteristický potenciál v jednotlivých pasážach. Vo výsledku bol pozorovaný vznik neklonálnych genetických nestabilít po 4. pasáži, avšak tieto alterácie môžu vymiznúť, alebo bunky podstúpia apoptózu.  Po 6. pasáži bol pozorovaný vznik klonálnych abnormalít, pričom následky týchto zmien môžu mať súvislosť so zmenou expresie génov asociovaných s rastom a proliferáciou buniek, diferenciáciou a signalizáciou bunka-bunka. No aj napriek abnormalitám v karyotype bola možná dlhodobá kultivácia ľudských MSCs bez straty ich imunomodulačných vlastností a multipotencie. Možno teda povedať, že hMSCs sú geneticky stabilné do 4. pasáže, pričom si zachovávajú status „clinical grade“ populácie pre efektívne a bezpečné klinické použitie. Vyššie pasáže však musia byť posudzované individuálne [4].

Vďaka týmto unikátnym vlastnostiam môžu byť MSCs použité v terapii rôznych poškodení tkanív. Tieto bunky sú už aktuálne súčasťou zabehnutých preparátov a postupov pri terapii mnohých ochorení, akými sú opravy poškodenia kostí, chrupiek a kardiovaskulárnych tkanív. Postupne sa však ich spektrum aplikácie rozširuje o ďalšie ochorenia, ako diabetes, cievne mozgové príhody, ochorenia na imunologickom podklade a niektoré druhy rakoviny [5]. Je však nutné ďalšie skúmanie nielen konečných mechanizmov pôsobenia, ale aj následnosť jednotlivých krokov v procese imunomodulácie a protektívneho pôsobenia MSCs. Rovnako je nutné hľadanie odpovedí na otázky, ako možno MSCs presne ovplyvniť, pre dosiahnutie ich požadovaného stupňa diferenciácie, a ako modulovať ich schopnosť migrácie. Cieľom ďalších výskumov by preto mala byť snaha o priblíženie sa k vlastnostiam niky kmeňových buniek v podmienkach in vitro.

Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja č. APVV-0684-12, grantom Operačného programu Výskum a Vývoj: MEDIPARK, Košice; ITMS: 26220220185 a grantom VEGA č. 1/0217/16.
  1. 1. Shi Y, Su J, Roberts AI, Shou P, Rabson AB, Ren G. How mesenchymal stem cells interact with tissue immune responses. Trends Immunol 2012, 33(3):136–43.
    2. Zachar L, Bačenková D, Soltys J, Rosocha J. Bioactive mediators associated with mesenchymal stem cells-mediated immunomodulation. J J Bone Stem Res. 2015, 1(2):006.
    3. Prockop DJ, Kota DJ, Bazhanov N, Reger RL. Evolving paradigms for repair of tissues by adult stem/progenitor cells (MSCs). J Cell Mol Med 2010, 14:2190–2199.
    4. Binato R, de Souza Fernandez T, Lazzarotto-Silva C, Du Rocher B, Mencalha A, Pizzatti L, et al. Stability of human mesenchymal stem cells during in vitro culture: considerations for cell therapy. Cell Prolif. 2013, 46(1):10-22.
    5. Farini A, Sitzia C, Erratico S, Meregalli M, Torrente Y. Clinical applications of mesenchymal stem cells in chronic diseases. Stem Cells Int. 2014;2014:306573.