Vplyv zatupenia mutačnej kazety na účinnosť transformácie

V životnom cykle sa druhy z rodu Candida vyskytujú diploidné alebo aneuploidné, preto je zložité ich študovať. Genetické metódy ako génové mapovanie priniesli len obmedzené množstvo informácií o ich genóme. Preto technológie rekombinantnej DNA predstavujú jedinú účinnú cestu k analýze genetickej informácie u Candidy, a to si vyžaduje efektívnu metódu transformácie pre efektívny prenos cudzorodej DNA do jej genómu [1]. Cieľom práce je predostrieť získané poznatky o vplyvu zatupenia mutačnej kazety na účinnosť transformácie po jej vnesenie do chromozómu C. utilis. V práci rozoberáme vplyv zatupovania pomocou jednotlivých polymeráz a ich vplyv na výslednú účinnosť transformácie. Na štiepenie plazmidu používame restrikčnú endonukleázu HindIII, ktorá zanecháva 5´prečnievajúce konce. V pokusoch používame 3 rôzne DNA polymerázy. Princíp zatupovania GoTaq DNA polymerázou spočíva v tom, že dosyntetizuje reťazce, no nezatupí konce úplne, ale na 3´konce pridáva adenozín [2]. DreamTaq polymeráza taktež pridáva na 3´konce adenozín. Rozdiel medzi týmito dvoma polymerázami je v tom, že GoTaq DNA polymeráza je Hot Start a teda si vyžaduje aktiváciu v denaturačnom kroku pri 95°C, kým DreamTaq DNA polymeráza nevyžaduje denaturačný krok [3]. Posledná nami používaná polymeráza je T4 DNA polymeráza, ktorá je schopná zatupovania pri laboratórnej teplote a zanecháva tupé konce.