Návrh konštruktov pre analýzu sekretómu v Candide utilis

Eukaryotické kvasinky sú schopné pomocou posttranslačných modifikácii sekretovať  heterologické eukaryotické proteíny v natívnej, biologicky funkčnej forme. Fermentácia zabezpečujúca rýchly rast buniek do vysokej hustoty buniek na chemicky definovaných médiách má obrovský význam pre large-scale priemyselnú produkciu heterológnych proteínov, kde je sekrečná expresia dôležitá pre zjednodušenie down stream procesov [1]. V súčasnej dobe existuje množstvo typov FDA-schválených terapeutických proteinov, ktoré sú produkované v kvasinkových systémoch [2].Napriek tomu, expresia heterológnych proteínov v kvasinkách má i svoje obmedzenia. Faktory ovplyvňujúce úroveň sekrécie heterológneho proteínu sú vlastnosťami cieľového proteínu, výber hostiteľského kmeňa, nedostatok expresných vektorov, výber promótorov, využitie kodónov, translačné signály, spracovanie a skladanie proteínov a taktiež samotná sekrécia. Z hľadiska sekrécie je veľmi dôležitá sekrečná signálna sekvencia, ktorá zabezpečuje a kontroluje vstup proteínov do sekrečných dráh. Sekretóm Candidy utilis nie je veľmi známy, avšak neprítomnosť proteolytických proteínov v jej sekretóme predurčuje túto kvasinku ako vhodný hostiteľský organizmus pre extracelulárnu expresiu. Znalosť genómovej sekvencie umožňuje porovnávanie tejto kvasinky s viacerými charakterizovanými druhmi, ako sú Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae [3].

Naša doterajšia práca spočívala v in silico analýze sekretómu Candidy utilis a príprave konštruktov, pomocou ktorých dochádza k ukotveniu enterokinázy do membrány endoplazmatického retikula smerom do lumenu ER. Ako sekrečný signál sme použili invertázový sekrečný signál, ktorý sa prirodzene nachádza v nami študovanej kvasinke. Na základe celogenómových porovnávaní so Saccharomyces cerevisiae sme identifikovali transmembránový úsek Kex2 proteázy, ktorej homológ by sa mal prirodzene nachádzať v Candide utilis. Za týmto úsekom se nachádza sekvencia ľudskej enterokinázy. Expresia celého konštruktu je pod kontrolou slabého konštitutívneho aktivátora ACT1.

Práca vychádza z projektu: Univerzitný vedecký park univerzity Komenského v Bratislave. ITMS: 26240220086., Vybudovanie Kompetenčného centra pre výskum a vývoj v oblasti molekulárnej medicíny. ITMS: 26240220071.

 [1] Porro D., Sauer M., Branduardi P.,et al. (2005) Mol Biotechnol. 31, p. 245.
 [2] Smith J., Tang B., Robinson A. (2004) Biotechnol. Bioeng. 85, p. 340.
 [3] Buerth C., Heilmann C. J., Klis F. M.,  et al. (2011) In. Microbiol. 157, p. 2493.