Využitie metódy pyrosekvenovania na hodnotenie metylácie v génoch súvisiacich s metastázovaním karcinómu prsníka

Authors: Lenka Kalinková 1    Ivana Fridrichová 1   
1 Ústav experimentálnej onkológie SAV, Bratislava,   
Year: 2015
Section: Cellular metabolism, physiology, molecular biology and genetics
Abstract No.: 1154
ISBN: 978-80-970712-8-8

Karcinóm prsníka patrí k najčastejším nádorovým ochoreniam u žien a tvorí viac ako 25 % zo všetkých typov nádorov vo väčšine európskych krajín. Frekvencia výskytu karcinómov prsníka stúpa so zvyšujúcim sa vekom žien a príčinou vysokej úmrtnosti (>25 %) je metastatické štádium (1,2). Tvorba metastáz prebieha vo viacerých krokoch od lokálnej invázie nádorových buniek, cez následné preniknutie do krvných a lymfatických ciev, prechod krvným systémom, extravazáciu do vzdialených orgánov až po vytvorenie mikro a následne makrometastáz (3). V uvoľňovaní nádorových buniek hrá dôležitú úlohu proces epiteliálno-mezenchymálneho prechodu (EMT), pri ktorom epiteliálne bunky stratia polaritu, bunkové kontakty, zmenia svoje vlastnosti a nadobudnú mezenchymálny charakter (4).

Cieľom práce je hodnotenie metylácie v 6 génoch asociovaných s invazivitou a metastázovaním karcinómov prsníka (uPA, TWIST1, SNAI1, SNAI2, ADAM23, CXCL12). Pre hodnotenie metylácie v regulačných oblastiach génov tzv. promótoroch sme zvolili kvantitatívnu metódu pyrosekvenovania, ktorá spočíva v meraní vyžiareného viditeľného svetla, čo zodpovedá množstvu zaradených nukleotidov do DNA reťazca počas polymerizácie.

Pyrosekvenovanie vyžaduje špecificky navrhnuté primery, na dizajn ktorých sme používali softvér PyroMark Assay Design 2.0 (Qiagen, Germany). Doposiaľ sme vygenerovali sady primerov pre 4 (uPA, TWIST1, SNAI1, SNAI2) zo 6 génov. Následne sme štandardizovali PCR reakcie pre získanie dostatočného množstva PCR produktov. Vytvorili sme nové pyrosekvenačné assay-e, ktoré sme overovali pomocou validačných reakcií na pyrosekvenátore (PyroMark Q24 System). Výsledky overovania sme vyhodnotili pomocou PyroMark Q24 2.0 Software (Qiagen, Germany).

Nakoľko onkologické ochorenia sú spôsobené nahromadením genetických ale aj epigenetických zmien, je štúdium epigenetických odchýlok dôležitou súčasťou onkologického výskumu. Keďže takéto zmeny môžu zohrávať významnú úlohu v tumorigenéze, môžu byť potenciálnymi markermi prognózy a predikcie liečby.

Táto práca bola podporená v rámci projektov: VEGA 2/0092/15, APVV-0076-10, projektu č. 26240220058 na základe podpory operačného programu Výskum a vývoj, ktorý bol financovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja.
  1. (1) Ferlay J., Steliarova-Foucher E., Lortet-Tieulent J., Rosso S., Coebergh J.W., Comber H., Forman D., Bray F. (2013). Cancer incidence and mortality patterns in Europe:estimates for 40 countries in 2012, Eur J Cancer, 49:1374-1403
    (2) BarinoffJ., Hils R., Bender A., Groß J., Kurz C., Tauchert S., Mann E., Schwidde I., Ipsen B., Sawitzki K. et al. (2012). Clinicopathological differences between breast cancer in patients with primary metastatic disease and those without: a multicentre study, Eur J Cancer, 49: 305-311
    (3) Klein, C.A. (2008). Cancer.The metastasis cascade, Science, 321: 1785-7
    (4) Kalluri R., Neilson E.G. (2003). Epithelial-mesenchymal transition and its implications for fibrosis, J Clin Invest, 112:1776-1784