Alkoholové multienzymové amperometrické biosenzory a ich využitie na monitorovanie kvasného procesu výroby medoviny

Amperometrické enzýmové biosenzory obsahujú citlivé prvky biologického pôvodu, ktoré sú buď súčasťou alebo v tesnom kontakte s fyzikálno-chemickým prevodníkom. Poskytujú priebežný elektronický signál, ktorý je priamo úmerný koncentrácii jednej alebo niekoľkých skupín chemických látok vo vzorke. Oproti rutinným technikám majú tieto biosenzory mnoho výhod z hľadiska jednoduchosti, selektivity odozvy, rýchlosti detekcie a nákladov na stanovenie.

Skladajú sa z troch hlavných častí: biologického rozpoznávacieho prvku (enzýmu/ov), prevodníka a zobrazovača signálu. Interakcia analytu s biologickým rozpoznávacím prvkom je prevedená na merateľný signál snímacej sústavy. Signál je potom premenený na odpočet alebo zobrazenie [1].

Enzýmové biosenzory vynikajú rýchlou odozvou a vyššou citlivosťou. Selektivita je potom riadená redoxným potenciálom analyzovaných látok prítomných vo vzorke. Bioelement pri oxidácii substrátu odovzdáva elektróny pracovnej elektróde, na ktorej povrchu dochádza k elektrochemickej regenerácii celej transportnej kaskády, čím sa celý redoxný kolobeh uzavrie. Základným predpokladom tohto tvrdenia je skutočnosť, že elektródová reakcia prebieha oveľa rýchlejšie ako transport analytu na elektróde. Rýchlosť určujúcim stupňom je potom transport elektroaktívnej látky k elektróde, pričom rýchlosť toho transportu sa s rastúcou hrúbkou difúznej vrstvy spomaľuje podľa druhého Fickovho zákona. Pri dostatočnom množstve enzýmu je teda rýchlosť reakcie v určitom rozsahu priamo úmerná koncentrácii analytu a je preto možné vytvoriť kalibračné krivky a kvantitatívne stanovovať obsah analytu [2,3].

Stanovenie alkoholu predstavuje dôležitú oblasť v liehovarníctve, vinárstve,  pri výrobe ovocných štiav (v tomto prípade na kontrolu jeho nežiaducej prítomnosti v dôsledku kvasenia) alebo tiež medoviny. Alkoholové biosenzory pracujúce na amperometrickom princípe využívajú spravidla dve elektródy, z nich prvá (meracia) je rozmerovo malá, polarizovatelná, druhá je väčšia, nepolarizovatelná (referenčná). Na meraciu a referenčnú elektródu sa vkladá tak veľké napätie, že je zaručené, že sledovaná látka na pracovnej elektróde podľahne elektrochemickej premene (oxidácii alebo redukcii). Elektrolytický prúd prechádzajúci medzi oboma elektródami je priamo úmerný množstvu sledovanej látky, ktorá podľahne elektrochemickej reakcii na meracej (polarizovanej) elektróde. Riadiacim dejom, ktorý rozhoduje o veľkosti prúdu, býva spravidla difúzny transport elektroaktívnej látky k elektróde [4].

Na biosenzorické stanovenie alkoholu je možné využiť enzýmy alkohol oxidázu alebo alkohol dehydrogenázu [5]:

Etanol + NAD⁺ —Alkohol dehydrogenáza→ acetaldehyd + NADH + H⁺

Etanol + O₂ —Alkohol oxidáza→ acetaldehyd + H₂O₂

NADH + H⁺ alebo H₂O₂ podstupujú ďalej premeny podľa mechanizmu:

NADH + H⁺ + [Med]_ox —Diaforáza→  [Med]red + NAD⁺

 H₂O₂ + [Med]_red —Peroxidáza→ [Med]_ox + H₂O

Pri monitorovaní kvasného procesu výroby medoviny, ktorý trval necelé dva mesiace, bolo odobraných 16 reprezentatívnych vzoriek. Tie boli následne analyzované na prístroji Omnilab-W, použitím biosenzorov s alkohol oxidázou.  

Táto práca vznikla v rámci riešenia projektu financovaného z Európskych štrukturálnych fondov s názvom Hodnotenie prírodných látok a ich výber pre prevenciu a liečbu civilizačných ochorení (ITMS 26240220040).

[1] Conroy, P.J., Hearty, S., Leonard, P., O’Kennedy, R.J. Antibody production, design and use for biosensor-based applications, Seminars in Cell & Developmental Biology, 2009, 20, 1, 10-26.
[2] Mello, L.D., Kubota, L.T. Review of the use of biosensors as analytical tools in the food and drink industries, Food Chemistry, 2002, 77, 2, 237-256
[3] Trögl, J. Biosenzory [on-line 20. apríla 2014]. Dostupné na: http://www.odbornecasopisy.cz/index.php?id_document=31055
[4] Miertuš, S., Katrlík, J., Pizzariello, A., Streďanský, M., Švitel, J., Švorc, J. Amperometric biosensors based on solid binding matrices applied in food quality monitoring, Biosensors & Bioelectronics, 1998, Volume 13, Issues 7-8, 911–923.
[5] Monosik, R., Streďanská, M., Tkáč, J., Šturdík, E. Application of Enzyme Biosensors in Analysis of Food and Beverages, Food Analytical Methods, 2012, 5, 1, 40-53.